ʻO IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) kahi analogue o ka substrate β-galactosidase, kahi mea hiki ke hoʻoulu ʻia. Ma lalo o ka hoʻoulu ʻana o IPTG, hiki i ka mea hoʻoulu ke hana i kahi paʻakikī me ka protein repressor, I loli ai ke ʻano o ka protein repressor, i hiki ʻole ke hui pū ʻia me ka gene target, a hōʻike pono ʻia ka gene target. No laila pehea e hoʻoholo ʻia ai ka nui o IPTG i ka wā o ka hoʻokolohua? ʻOi aku ka maikaʻi o ka nui?
ʻO ka mea mua, e hoʻomaopopo kākou i ke kumumanaʻo o ka hoʻokomo ʻana o IPTG: Loaʻa i ka lactose operon (element) o E. coli ʻekolu mau genes structural, ʻo Z,Y, a me A, nāna e hoʻopili i ka β-galactosidase, permease, a me acetyltransferase, kēlā me kēia. Hoʻohuihui ʻo lacZ i ka lactose i loko o ka glucose a me ka galactose, a i ʻole i loko o ka allo-lactose; ʻae ʻo lacY i ka lactose i loko o ke kaiapuni e hele ma waena o ka membrane cell a komo i loko o ke cell; Hoʻoili ʻo lacA i ka hui acetyl mai acetyl-CoA i β-galactoside, e pili ana i ka wehe ʻana i ka hopena Toxic. Eia kekahi, aia kahi kaʻina hana O, kahi kaʻina hoʻomaka P a me kahi gene hoʻoponopono I. ʻO ke code gene I he protein repressor hiki ke hoʻopaʻa i ke kūlana O o ka kaʻina hana, i hiki ai ke kāohi ʻia a pio ka operon (meta). Aia kekahi wahi hoʻopaʻa no ka pūnaewele hoʻopaʻa protein-CAP catabolic gene activator ma luna o ka kaʻina hoʻomaka P. ʻO ka kaʻina P, ka kaʻina O a me ka pūnaewele hoʻopaʻa CAP e hui pū ana e hana i ka ʻāpana hoʻoponopono o ka lac operon. Hoʻoponopono ʻia nā genes coding o nā enzymes ʻekolu e ka ʻāpana hoʻoponopono like e hoʻokō ai i ka hōʻike ʻana i hoʻonohonoho ʻia o nā huahana gene.
I ka loaʻa ʻole o ka lactose, aia ka lac operon (meta) i ke kūlana o ka hoʻopaʻa ʻana. I kēia manawa, ʻo ka lac repressor i hōʻike ʻia e ka moʻo I ma lalo o ka mana o ka moʻo hoʻolaha PI e hoʻopaʻa i ka moʻo O, ka mea e pale ai i ka RNA polymerase mai ka hoʻopaʻa ʻana i ka moʻo P a kāohi i ka hoʻomaka ʻana o ka transcription; ke loaʻa ka lactose, hiki ke hoʻoulu ʻia ka lac operon (meta) Ma kēia ʻōnaehana operon (meta), ʻaʻole ʻo ka inducer maoli ka lactose ponoʻī. Komo ka Lactose i loko o ke keena a hoʻoulu ʻia e β-galactosidase e hoʻololi ʻia i allolactose. ʻO ka mea hope, ma ke ʻano he mole inducer, e hoʻopaʻa i ka protein repressor a hoʻololi i ke ʻano o ka protein, kahi e alakaʻi ai i ka dissociation o ka protein repressor mai ka moʻo O a me ka transcription. Loaʻa iā Isopropylthiogalactoside (IPTG) ka hopena like me allolactose. He inducer ikaika loa ia, ʻaʻole i metabolized e ka bacteria a paʻa loa, no laila ua hoʻohana nui ʻia i nā keʻena hoʻokolohua.
Pehea e hoʻoholo ai i ka nui kūpono o IPTG? E lawe iā E. coli ma ke ʻano he laʻana.
Ua hoʻokomo ʻia ke ʻano E. coli BL21 i hana ʻia ma ke ʻano genetic me ka pGEX recombinant maikaʻi (CGRP/msCT) i loko o kahi wai LB me 50μg·mL-1 Amp, a ua hoʻoulu ʻia i ka pō ma 37°C. Ua hoʻokomo ʻia ka moʻomeheu i luna i loko o 10 mau ʻōmole o 50mL wai LB hou me 50μg·mL-1 Amp ma ka lakio o 1:100 no ka hoʻoulu ʻana i ka hoʻonui ʻana, a i ka wā i 0.6~0.8 ai ka waiwai OD600, ua hoʻohui ʻia ʻo IPTG i ka nui hope loa. ʻO ia hoʻi 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Ma hope o ka hoʻokomo ʻia ʻana ma ka mahana like a me ka manawa like, ua lawe ʻia he 1 mL o ka hopena bacteria mai ia mea, a ua hōʻiliʻili ʻia nā pūnaewele bacteria ma o ka centrifugation a ua hoʻokau ʻia i ka SDS-PAGE e kālailai i ka mana o nā ʻano like ʻole o ka IPTG ma ka hōʻike ʻana o ka protein, a laila koho i ka ʻano IPTG me ka hōʻike protein nui loa.
Ma hope o nā hoʻokolohua, e ʻike ʻia ʻaʻole nui ka nui o ka IPTG e like me ka hiki. ʻO kēia no ka mea he ʻawahia ko IPTG i nā bacteria. ʻO ka ʻoi aku o ka nui e pepehi pū i ke kelepona; a ma ke ʻano laulā, ke manaʻolana nei mākou ʻo ka protein hiki ke hoʻoheheʻe ʻia i loko o ke kelepona, ʻoi aku ka maikaʻi, akā i nā hihia he nui ke kiʻekiʻe loa ka nui o ka IPTG, e hoʻokumu ʻia ka nui o ka hoʻokomo ʻana. Kino, akā ua emi ka nui o ka protein hiki ke hoʻoheheʻe ʻia. No laila, ʻo ka nui o ka IPTG kūpono loa ʻaʻole pinepine ka nui o ka maikaʻi, akā ʻo ka haʻahaʻa o ka nui.
ʻO ke kumu o ka hoʻoulu ʻana a me ka mahi ʻana i nā ʻano hana genetically i hana ʻia, ʻo ia ka hoʻonui ʻana i ka hua o ka protein target a me ka hoʻemi ʻana i nā kumukūʻai. ʻAʻole wale ka hoʻopili ʻia ʻana o ka gene target e nā mea ponoʻī o ke ʻano a me ka plasmid expression, akā e nā kūlana waho ʻē aʻe, e like me ka nui o ka inducer, ka mahana induction a me ka manawa induction. No laila, ma ke ʻano laulā, ma mua o ka hōʻike ʻia ʻana a me ka hoʻomaʻemaʻe ʻia ʻana o kahi protein i ʻike ʻole ʻia, ʻoi aku ka maikaʻi o ke aʻo ʻana i ka manawa induction, ka mahana a me ka nui o IPTG i mea e koho ai i nā kūlana kūpono a loaʻa nā hopena hoʻokolohua maikaʻi loa.
Ka manawa hoʻouna: Dec-31-2021